无核和香味是葡萄果实的重要品质特性，也是深受消费者欢迎的性状。目前，市场上无核且具有香味的葡萄品种较缺乏，培育香味无核的新品种是当前葡萄育种的重要目标之一。作为无核葡萄育种最有效的方法，胚挽救技术可将杂交后代的无核率提高到82%，育种周期比常规杂交育种至少缩短5年，因此，该技术得到越来越多的应用。迄今为止，国内外研究者通过胚挽救技术已经培育出一批无核葡萄新品种。然而，胚挽救的成功受许多因素的影响，包括亲本基因型、取样时期、培养基以及花前施用激素等，其中亲本基因型占主导地位。败育时胚发育程度较高的品种、胚较大的品种更适合作胚挽救的母本，父本基因型对胚珠数量和取样时间也会产生一定影响。

本研究以4个种子败育型葡萄品种红宝石无核（RS）、爱神玫瑰（AS）、火州紫玉（HZ）和无核翠宝（WH）为母本，分别与玫瑰香型葡萄品种巨玫瑰（JM）、爱神玫瑰、阳光玫瑰（SM）和玫瑰香（MH）杂交，通过胚挽救技术创制一批玫瑰香型无核葡萄新种质，同时比较不同亲本对胚挽救效果的影响，并利用无核基因分子标记VviAGL11-KASP和玫瑰香型基因分子标记VviDXS-KASP辅助选择杂交后代，为进一步选育玫瑰香型无核葡萄新品种奠定基础。

试验于2023年在河南现代农业研究开发基地葡萄试验园和河南省农业科学院园艺研究所进行。用于杂交的7个亲本均为10年生以上成龄树，采用简易避雨栽培，株行距1.5m×3m，南北行向，高宽垂架式，T形整形，常规管理。供试亲本特性如表1所示。

春季，父本植株花序约5%小花开放时，采集饱满花穗，先剔除已开放的小花，然后在洁净硫酸纸上剥离花冠，取出花药，放在灯管下晾晒至花粉散出，过筛后收集到10mL离心管中，封口，并置于盛有无水CaCl2的密闭容器中，保存于4°C冰箱备用。花前3～4d，用指尖小心去除母本的花冠及雄蕊，避免伤到柱头，用蒸馏水冲洗2遍花穗以达到保湿和去除残留花粉的目的，去雄后即刻套袋。去雄后2～3d，当柱头上出现粘液时，于上午7:00—9:00进行授粉，授粉完成即刻套袋，并标识杂交组合和授粉日期。去雄授粉期间手及所有器具用75%酒精消毒，避免花粉污染。

4个母本品种RS、AS、HZ、WH取样时期分别为花后61d、45d、50d、36d，其中HZ的取样时期在转色期。

幼果用流水冲洗干净后，放入超净工作台中。先用75%酒精消毒30s，再用无菌水漂洗2～3次，然后用2%NaClO消毒20min，最后用无菌水漂洗2～3次。将消毒后的幼果放在无菌培养皿中剥取胚珠，挑选长度在2mm以上的胚珠接种于ER固体培养基，每瓶接种15个胚珠，在25±1℃的培养室内暗培养。培养基的制作参照Zhu等的方法：采用容量为200mL培养瓶，每个瓶中加入40mL固体ER培养基，附加成分包括0.5g·L^-1水解酪蛋白、1.0mmol·L^-1丝氨酸、1.0mg·L^-1IAA、0.5 mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1GA3、60.0g·L^-1蔗糖和3.0g·L^-1活性炭、7.0g·L^-1琼脂，pH为5.8，121℃高压蒸汽灭菌25min。

胚珠在黑暗条件下培养8～9周后，超净工作台中切开胚珠，取出亮白色胚（图1E）进行胚萌发培养。胚萌发成苗培养基为固体WPM培养基（WPM+0.2mg·L^-16BA+0.1mg·L^-1IBA+20g·L^-1蔗糖+1g·L^-1活性炭+7g·L¹琼脂），25±2℃进行光照培养，使其萌发成苗。此期间，统计胚发育率、萌发率、成苗率。

当试管苗长至近瓶口时，进行继代培养（½ MS+0.2mg·L^-1 IBA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂），每月继代一次。

采用试剂盒（ND26F，诺莱梅，北京）从亲本及其杂种苗幼叶中提取基因组DNA，并保存于-80 ℃。根据徐炎等（2022）的方法使用引物VviAGL11-KASP-Fa/Fb/R进行无核基因分子标记检测，对于无法准确区分的样品使用引物VviAGL11-400-F/R进行PCR扩增后送生工生物工程（上海）公司测序。根据王勇等（2023）方法使用引物VviDXS-KASP-Fa/Fb/R进行玫瑰香型性状鉴定。

有关胚发育率、萌发率和成苗率的试验数据进行3次重复，使用IBM SPSS 23.0中ANOVA单因素方差分析，显著性分析选用邓肯氏新复极差检验法（P<0.05）。

7个杂交组合共剥取胚珠5466个，发育胚935个，萌发胚607个，成苗316株，平均成苗率为5.78%。其中，组合RS×MH胚发育率最高，为26.96%；组合RS×SM的胚萌发率和成苗率最高，分别为17.42%和11.36%，上述2个组合的胚发育率、胚萌发率和成苗率之间差异不显著。7个杂交组合中，胚发育率最低的是AS×JM，胚萌发率和成苗率最低的是WH×JM（表3）。

从表3中可以看出，RS×JM的胚发育率、萌发率、成苗率均显著高于AS×JM和WH×JM，以JM为父本时，RS比AS和WH更适合作母本；当以AS为父本时，以RS为母本杂交的胚挽救效率显著高于以HZ为母本的杂交组合，RS比HZ更适合作母本与AS杂交。

在同以RS为母本的杂交组合中，RS×SM和RS×MH的胚挽救效率显著高于其他2个杂交组合，4个杂交组合的成苗率均高于5%。因此，以RS为母本时，SM、MH、JM和AS均可为父本，且SM和MH比JM和AS更适合作父本。

2.4.1 无核分子标记对杂交亲本及后代的检测

对杂交亲本RS、AS、HZ和WH的检测结果为基因型A:C，表现为无核；SM、JM和MH的检测结果为基因型C:C，表现为有核（图1A）。对杂交后代进行VviAGL11-KASP检测，结果显示RS×AS后代117个植株中有53个基因型为A:C，21个基因型为A:A，表现为无核（图1B），对无法准确区分的3个植株，使用VviAGL11-400进行扩增后测序，结果显示其中2个植株表现为无核（图2），RS×AS杂交后代无核率为64.96%；RS×SM杂交后代75个植株中有21个基因型为A:C，2个基因型为A:A，表现为无核（图1C），对无法准确区分的17个植株，测序结果显示均表现为无核（图2），RS×SM杂交后代无核率为53.33%；RS×MH杂交后代58个植株中有37个基因型为A:C，5个基因型为A:A，表现为无核（图1D），对无法准确区分的2个植株，测序结果1个表现为无核（图2），RS×MH杂交后代无核率为74.14%；RS×JM的28个杂交后代中，26个基因型为C:C，表现为有核（图2E），对无法准确区分的2个植株，测序结果1个表现为无核（图2），RS×JM杂交后代无核率为3.57%；AS×JM的27个杂交后代中，2个基因型为A:C，表现为无核（图1F），对无法准确区分的5个植株，测序结果均表现为无核（图2），AS×JM杂交后代无核率为25.93%；HZ×AS的10个杂交后代中，5个基因型为A:A，表现为无核（图1G），对无法准确区分的3个植株，测序结果均表现为无核（图2），HZ×AS杂交后代无核率为80.00%；WH×JM的1个杂交后代检测结果基因型为A:C，表现为无核（图1H）。综上，7个杂交组合的316个后代中检测出176个无核植株，平均无核率为55.70%。

2.4.2 玫瑰香型分子标记对杂交后代的检测

对杂交亲本WH、AS、SM、JM、MH的检测结果为基因型G:T，表现为玫瑰香型；RS和HZ的检测结果为基因型G:G，表现为无香型（图3A）。对杂交后代进行VviAGL11-KASP检测，结果显示，RS×AS后代117个植株中检测出42个植株基因型为G:T，11个植株的基因型为T:T（图3B），表现为玫瑰香型，RS×AS获得玫瑰香型杂交后代的比率为45.30%；RS×SM杂交后代中，75个植株中有7个基因型为G:T，28个基因型为T:T（图3C），表现为玫瑰香型，RS×SM获得玫瑰香型杂交后代的比率为46.67%；RS×MH杂交后代58个植株中有39个基因型为G:T，12个基因型为T:T（图3D），表现为玫瑰香型，RS×MH获得玫瑰香型杂交后代的比率为87.93%；RS×JM杂交后代中，28个植株中有11个基因型为G:T，6个基因型为T:T（图3E），表现为玫瑰香型，RS×JM获得玫瑰香型杂交后代的比率为60.71%；AS×JM杂交后代27个植株中有3个基因型为G:T，23个基因型为T:T（图3F），表现为玫瑰香型，AS×JM获得玫瑰香型杂交后代的比率为96.30%；HZ×AS的10个杂交后代未检测出玫瑰香型后代（图3G）；WH×JM的1个杂交后代基因型为T:T（图3H），表现为玫瑰香型。综上，7个杂交组合的316个后代中检测出183个玫瑰香型植株，获得玫瑰香型后代的比率为57.91%。

经检测，组合RS×AS有36个杂交后代同时具有无核和玫瑰香型基因标记，RS×MH有39个，RS×SM有27个，AS×JM有7个，WH×JM有1个。316个杂交后代中同时具有无核及玫瑰香型标记的植株有110个，占比为34.81%。

合子胚的形成能力和发育进程受亲本基因型的严格控制，母本基因型显著影响胚挽救效果。此外，胚挽救的效率还与母本成熟期有关，早熟品种胚发生败育较早，发育程度低，不适宜用作胚挽救母本，晚熟品种胚挽救成功率较高。近年来，学者多以胚挽救的成苗率来评价种子败育型品种的可挽救性，胚挽救成苗率低于5%的葡萄品种不适合作母本。本研究中，以晚熟品种RS为母本的4个杂交组合成苗率均高于5%，因此，RS比较适宜作胚挽救母本，与前人研究结果一致。以早熟品种AS和WH作母本的杂交组合成苗率低于5%，不适宜作胚挽救母本，晚熟品种HZ由于胚珠较小，可挽救性也很差。同以RS为母本的4个杂交组合由于父本不同，胚发育率、萌发率与成苗率也有显著差异，表明父本基因型也会对胚挽救效果产生一定的影响，这可能是因为父本会通过影响胚的发育进程而影响发育胚的数量，从而影响到胚挽救的效率。

无核性状遗传较为复杂，其规律尚未完全揭示。本研究选用VviAGL11-KASP对7个杂交组合后代进行检测。其中RS×AS后代无核率为64.96%，HZ×AS后代的无核率为80.00%，与Ramming的结果无核×无核后代无核率45%～85%相符合；而5个无核×有核杂交组合后代的无核率介于3.57%～100%。推测杂交后代无核率差异大的原因是3个组合RS×JMAS×JMWH×JM是二倍体与四倍体杂交，染色体不配对，存在杂交不亲和问题导致后代样本量较小，存在实验误差。

研究表明，葡萄的玫瑰香气与单萜类化合物的存在有关，主要包括香叶醇、里那醇、橙花醇、香茅醇、α-松油醇等。有研究者对鲜食葡萄果实单萜合成关键基因进行eQTL定位及候选基因挖掘，共检测到37个与单萜合成途径基因表达相关的eQTL。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）是调节葡萄果实中单萜类物质合成的主要调节因子。王勇等（2023）参照葡萄DXS位点信息合成KASP标记引物序列，对27个品种资源果实萜类物质调控基因DXS位点基因型进行检测，发现该标记对葡萄香型物质调控位点的基因型检测具有较高准确性。本研究中，AS×JM后代经检测玫瑰香型比率达96.30%，显著高于以RS为母本的杂交组合，表明葡萄果实香味遗传倾向趋向亲本，双亲均具有玫瑰香味的杂交组合比单亲具有玫瑰香味的杂交组合更易获得玫瑰香味的后代。在以‘红宝石无核’为母本的4个杂交组合中，RS×MH获得玫瑰香型后代的比率显著高于以JMAS和SM为父本的杂交组合。因此，同样的母本条件下，选择MH作父本更易获得玫瑰香型后代。

综上，亲本基因型对胚挽救效果有显著的影响，以母本影响更大。RS较适合作为无核葡萄胚挽救的母本，SM和MH比JM和AS更适合作父本与RS杂交。通过胚挽救共获得316个新种质，其中176个具有无核标记，183个具有玫瑰香型标记，同时具有无核和玫瑰香型标记的有110个，占比为34.81%。选择双亲均无核或具有玫瑰香味的杂交组合更易获得玫瑰香型无核葡萄后代。