微生物风土研究进展

发布时间:2025-03-21 | 稿件来源:志昌农业
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葡萄酒酿造体系是一个极其复杂的混菌发酵系统,系统内微生物菌群结构复杂,且存在生态、地理多样性。研究表明,不同产区葡萄酒微生物的群落结构特征是其所处葡萄酒产区的各种生态因子综合作用的结果,表现出与葡萄酒感官和风味代谢物谱同样的产区特征(Bokulich et al. 2014; Vega-Avila et al. 2015)。Bokulich 等(2014)首次提出葡萄酒的“微生物风土”概念,即把葡萄酒微生物的群落结构特可以表现出产区特异性的特点,叫做葡萄酒的“微生物风土”(microbial terroir)。这一概念的提出,将微生物列为葡萄酒风土因子的重要组成部分,对其研究也成为近年热点(Belda et al. 2020; Belda et al. 2017; Capozzi et al. 2015)。高通量测序技术成熟与普及,使得整体把握葡萄酒的微生物群落结构、进而揭示葡萄酒的微生物风土特征成为可能(Belda et al. 2020)。


一、对葡萄酒风味特征的影响

葡萄园及果表微生物种类和丰度在分布上存在独特的风土特性,对产区葡萄酒感官特征有重要影响(Gilbert et al. 2014; Stefanini and Cavalieri 2018)。建立微生物群落与风味物质的关联关系,一直是发酵食品微生物领域的重要课题。基于培养组学的方法已比较成熟,主要通过气相 GC-MS 与 GC-O 结合的方法确定对风味有重要贡献的挥发性组分,再通过可培养的手段研究原位微生物群落结构并确定核心微生物,通过原位菌群构建对上述结果进行验证,确定了可培养条件下核心香气成分与可培养核心微生物的关联。应用此策略,针对酱香型白酒中重要活性香气成分四甲基吡嗪,发现了高产该物质的芽孢杆菌(Zhu et al. 2010; Zhu and Xu 2010)。在葡萄酒研究中,通过相似的方法,Knight 等(2015)将培养组获得的核心菌群进行发酵验证,结果证明了酵母种内差异能够区分产区香气特征,但是并未找到核心香气组分与菌株的关系

而在非培养条件下,葡萄酒复杂发酵体系中微生物群落与发酵风味物质的关联研究,大多基于统计分析。现有研究主要在自然发酵过程中监测微生物群落动态变化和葡萄酒挥发性化学物质轮廓,然后通过采用等方法,将微生物种类和丰度数据与葡萄酒香气数据进行关联分析,预测得到了某些微生物与挥发性代谢产物之间可能性关系(Chen et al. 2016; Chen et al. 2020; Di et al. 2021; Wang et al. 2020)。Wang 等(2020)通过微生物组成与葡萄酒化学成分关联,发现丝状真菌枝孢菌和芽孢杆菌科与 C6 酮酸显著相关,推断酸和醛是区域差异化的关键特征,但没有关联到某些核心微生物种类;Chen 等(2020)通过统计分析的方法揭示了冰酒发酵过程中 8 个细菌属和 9 个真菌属与 24 种挥发性化合物的形成显著相关,但未进行验证。微生物组-代谢组(挥发物物质组)数据集分析研究方法,旨在全面识别代谢变化的微生物驱动因素。这些研究证实了在发酵过程中微生物菌群对葡萄酒代谢谱有显著的影响,但仅依据数据相关性分析不能够获得贡献产区特征香气的核心菌群组成。


二、微生物群落多样性研究技术

在葡萄园中、酿酒厂和发酵过程中存在的微生物种群的组成已经通过传统的微生物学方法进行了广泛的研究(Morgan et al. 2017),基于培养的方法依赖于在实验室培养基上分离微生物,并通过生化分析、显微镜和分子生物学对其进行鉴定和鉴定。然而,以培养为基础的方法往往不能识别不可培养和样品中频率较低的微生物。Ampe 等(1999)证明了至少 25-50%的微生物群落不能在实验室条件下培养,这是可培养方法十分明显的缺点。此外,仅使用生化和表型特征来识别微生物是不够的,因为在物种进化中可能会发生表型的并行和逆转(Guzmán et al. 2013; Kurtzman and Robnett 1994),例如,念珠菌属(Candida),最初定义为“以多边出芽分裂但没有独特细胞形态的无性酵母”,而现在被认为是一个多系属,并正在进行修订,以使物种分组与系统发育亲缘一致(Daniel et al. 2014)。这些限制突出了发展非培养技术的必要性,高通量测序(HTS)方法的出现满足了这些需求,使得在葡萄果实和发酵体系等复杂样本中识别细菌和真菌成为可能。

由于 HTS 的出现,主要有两种学方法可以用来分析微生物种群的组成。一种是基于已知能够区分微生物的目标序列的测序(即扩增子测序),扩增子测序技术是 PCR 扩增和后期测序基因标记的特定区域的方法,通过测序特定基因(或片段),可以识别属甚至物种级别的微生物,如细菌的 16S rRNA 基因,酵母和真菌的 D1/D2 26S rRNA 基因或内部转录间隔区(ITS)(Cao et al. 2017)。一种方法是可从给定样本中提取的完整 DNA 库进行测序(即宏基因组测序)。宏基因组测序不是对目标 DNA 区域进行测序,而是对从给定样本中提取的所有 DNA 进行测序,以识别样本中存在的生物体或获取其他信息。与扩增子测序方法相比,全基因组测序成本更高,但其不包含任何引物选择偏好,因此 PCR 扩增步骤产生的偏倚更少。该方法可以准确鉴定微生物,但由于测序深度的限制,可能会低估稀有或低丰度物种的分类丰度估计。然而,对基于扩增子测序和宏基因组测序技术的一些直接比较的研究表明,这两种方法确定了高度相似的微生物群落,且全基因组测序方法捕捉到了更高水平的多样性(Poretsky et al. 2014)。全基因组测序中真菌和细菌种群的组成可以通过单轮全基因组测序进行剖析,因此可用于比较细菌和真菌的相对丰度(Cao et al. 2017)。且该方法更有在物种甚至菌株水平上特征化微生物的潜力。此外,全基因组测序方法还允许直接识别具有相关功能作用的基因,而扩增子测序方法只能基于开发的数据库进行推断微生物的部分功能,且容易受到横向基因转移或删除的影响。此外,这种方法还可能识别某些基因组未进行过测序的生物体中以前未知的功能。

目前,关于葡萄酒产区微生物多样性的研究基本上是基于扩增子测序方法,尽管可以从整体上描述和比较微生物群落结构(Stefanini et al. 2016),但其分辨率不足以解析菌株水平上的微生物种群。而已有研究表明,从不同地理位置分离的酿酒酵母显示出不同的遗传和表型特征,这说明酿酒酵母存在地理特定谱系(Yarza et al. 2014)。因此,目前微生物个体水平的多样性解析仍需要可培养法的支持。


三、国内外产区微生物风土研究进展

全球著名葡萄酒产区,如美国纳帕谷(Burns et al. 2015)、法国勃艮第产区(Grangeteau et al. 2017)、意大利伦巴第产区和西班牙里奥哈产区(Mezzasalma et al. 2018)、新西兰中奥塔哥产区(Knight et al. 2020)等都已展开了产区微生物风土的相关研究。这些土壤、葡萄园、酿造环境、果表和初始发酵醪的微生物群落结构测序表明,各产区的细菌群落、真菌群落结构均呈现显著差异,表现出复杂的气候地理特异性。不同产区对微生物群落的影响因素在重要程度上有显著差异,如在美国纳帕产区,葡萄品种和气候因素(温度和湿度)对微生物群落影响最大(Bokulich et al. 2014);在法国勃艮第的研究发现,年份对微生物群落的结构具有最显著的影响(Grangeteau et al. 2017)。果表真菌与葡萄园真菌群落结构不同,并随着葡萄成熟种类逐渐减少部分丝状真菌、非酿酒酵母和酿酒酵母决定了发酵初始菌群结构

利用高通量测序技术研究国内葡萄酒环境及发酵微生物群落结构的报道较少,结果都显示葡萄园及发酵过程的微生物结构具有产区差异。Wei 等(2018)首次对新疆产区的三个不同地区酒庄的赤霞珠葡萄展开了微生物多样性研究,取样涉及土壤、葡萄、叶片、葡萄醪以及葡萄酒。结果表明,不同区域微生物多样性存在差异。Gao 等(2019)对新疆北部的六个葡萄酒产区的四个葡萄品种的微生物多样性展开了研究,其结果表明新疆不同地区酿酒葡萄表皮上的微生物群落结构受环境因素的影响,且真菌群落组成的复杂性明显高于细菌群落组成的复杂性。还有一项研究对中国西南的贵州产区的单个葡萄园土壤中的细菌和真菌群落进行了研究,且其研究结果表明细菌多样性显着高于真菌多样性(Liang et al. 2019)。



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